轉染試劑的操作小步驟

  我們經常會用到轉染試劑來轉染一些細胞，那您知道一些具體的操作步驟嗎？下面將詳細為您講解具體的實驗步驟。

  轉染前 ：

   首先，準備細胞、質粒和實驗所需試劑。細胞可以取實驗室里已經驗證的易轉染細胞株，如COS-1/Hela/CHO-K1細胞，同時實驗前要重新復蘇一株低傳代細胞來確保該細胞株未被其他細胞和微**污染。選擇表達質粒載體如β-gal載體，GFP載體等時，要先確保該質粒能在所選的細胞系中表達良好。同時質粒純化時要注意純化過程中勿使雙鏈斷裂以及無核酸酶和內**污染。同時準備新鮮的培養基，使用前用0.22um濾膜過濾培養基來確保培養基無污染。細胞培養過程中勿加***，且需要不斷監測細胞的生長情況。當細胞密度達到50-80%時，可用于細胞轉染。

2.轉染中：

  首先，由于不同質粒和脂質體的較適合的搭配比例不同，轉染前應該做預實驗來摸索一個較合適的配比。作預實驗時，按照質粒：脂質體=1:1、1:2、1:3、1:4的梯度來檢測比較合適的轉染比例，同時也需要設立對照實驗，如試劑對照：僅加入轉染試劑，可確定轉染試劑對細胞**。DNA對照：僅加入DNA，確定制備DNA的質量是否對細胞存在影響。空白對照：用空載體制備轉染試劑復合物（建議3：1的比例），確定轉染后細胞生理或功能的變化是源于目標基因，還是源于轉染過程本身。 其次，在正式實驗中，需要小心輕柔將lipo2000加到培養基中并輕輕混勻，避免大力吹打，使得脂質體失效。

3.轉染后：

   首先，轉染24h后需要觀察轉染過程對細胞**情況，如果**比較高，可能是由以下原因造成的： *初期細胞接種濃度太低*轉染復合物加入量過高，因為不同細胞對轉染的敏感度不同*轉染后6小時需更換培養基，一是lipo2000具有一定**，二是培養基需要更換成有血清培養基。 其次，轉染后需要對轉染效率進行檢測，比如觀察轉染后細胞熒光情況、qPCR驗證或WB檢測敲減或者過表達蛋白。 *對于β-gal表達載體：可用β-gal染色***進行細胞染色并觀察細胞。轉染效率高的細胞在染色孵育后3-4h即可觀察到，轉染效率低的細胞則需要更長的孵育時間。 *對于GFP表達載體：熒光顯微鏡下觀察細胞。如果細胞能在顯微鏡下被觀察到，至少需要有104-105拷貝的GFP蛋白表達，表達太弱的細胞無法鏡檢。GFP表達情況也能使用流式細胞儀進行檢測，同時可加入PI進行染色以監測死細胞情況。 **，若是轉染后發現轉染效率不高，可以通過兩種方法增強轉染效率。 （1）復轉染，即轉染后12-24小時再次進行轉染，前提是該細胞對脂質體的耐受性較好，轉染后細胞死亡數較少。 （2）通過*篩來殺死未轉入成功的細胞。前提是該質粒帶有***抗性的基因。

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  看完這些，您是不是更加了解該如何進行轉染實驗了呢？